Uygulama Notu AN M133

Biyolojik Örneklerin Kızılötesi Mikrospektroskopik Görüntülemesi

Biyolojik dokuların analizi tipik olarak mikroskobik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Görsel kontrastın olmayışı nedeniyle ilgilenilen yapıları vurgulamak için boyama prosedürleri gereklidir. Ayrıca bileşenlerin (örneğin proteinler, karbonhidratlar, lipitler) ve hastalıkları gösteren desenlerin (örneğin kanser, nörodejenerasyon) spesifik görselleştirilmesi için boyaların kullanıldığı basit boyama yöntemleri genellikle yeterli değildir ve immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılır. Bu boyama yöntemi, doku örneğindeki antijenlere spesifik olarak bağlanan antikorları uygular. Prensip olarak bu yöntem oldukça etkili ve çok hassastır. Ancak numune hazırlama prosedürü çok zaman alıcı ve karmaşık olup birçok potansiyel hata kaynağına neden olur. Ciddi dezavantajlar, güçlü arka plan lekelenmesine ve hedef antijenin zayıf lekelenmesine yol açan çapraz reaksiyonlardır; bunların her ikisi de yetersiz kontrasta yol açar.

FT-IR mikroskobu, köklü boyama yöntemlerine çok hızlı ve etkili bir alternatif oluşturur. Minimal numune hazırlığıyla ve kontrast artırıcı herhangi bir ajana ihtiyaç duymadan biyolojik numunelerin analiz edilmesine olanak tanır. Ölçülen spektrum, IR ışığının numuneyle etkileşiminin bir sonucudur ve biyokimyasal bileşimini yansıtır.

Çok elemanlı odak düzlemi dizisi (FPA) dedektörleri kullanılarak, yalnızca ışığın kırınımıyla sınırlı olan yanal çözünürlükle binlerce spektrumu aynı anda ölçmek mümkündür. Bir FPA ölçümünün sonucu, ölçülen numune alanının kimyasal bileşimi ve bileşimi hakkında karmaşık bilgiler taşıyan bir spektral matristir. Analiz için entegrasyon, kümeleme analizi veya temel bileşenler analizi gibi değerlendirme yöntemleri uygulanır. Sonuçta ortaya çıkan "kimyasal görüntüler", tek tek kimyasal bileşenlerin dağılımını veya dokunun belirli spektral özelliklerini görselleştirir ve görsel mikroskobik görüntüyle üst üste bindirilebilir.

FT-IR görüntüleme, biyolojik yapıların kimyasal yapısını ortaya çıkarır ve proteinleri, lipitleri, polisakkaritleri vb. tanımlar. Birçok bilimsel çalışmada, yöntemin kanser hücreleri ile normal hücreler arasında ayrım yapılmasına olanak sağladığı gösterilmiştir. Ek olarak, proteinlerin farklı yapısal formları (α-sarmal, β-yaprak ve rastgele bobin) ve yağ asitleri (doymamışlık derecesi) ayırt edilebilir. Hücre hasarının histolojik kalıpları tam olarak lokalize edilip tanımlanabildiğinden Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklar hakkında değerli bilgiler elde edilir. Şimdiye kadar IR görüntüleme yalnızca araştırma amacıyla kullanıldı. Gelecekte, bilimsel topluluk, yöntemin tıbbi teşhiste güçlü bir araç haline gelmesini ve mevcut boyama tekniklerine kıyasla daha objektif olan daha hızlı sonuçlar vermesini beklemektedir.

Şekil 1: TENSOR II ile HYPERİON 3000 mikroskobu

Enstrümantasyon

HYPERİON FT-IR mikroskobu, optimum örnek görselleştirme ve kızılötesi veri toplama için son teknoloji optikler kullanır. Birçok kontrast geliştirme aracı ve çok çeşitli özel hedefler, herhangi bir numunenin uygun bir görsel incelemesini sağlar. En yüksek uzamsal çözünürlükte bile HYPERİON, tüm ölçüm modlarında olağanüstü bir hassasiyet sergiler. iletim, yansıma ve zayıflatılmış toplam yansıma (ATR). 

128x128 elemente kadar çok elemanlı bir FPA dedektörü ile donatılmış HYPERİON 3000 mikroskobu (bkz. Şekil 1) aynı anda binlerce spektrumun ölçülmesine izin verir. Yüksek çözünürlüklü kimyasal görüntüler sadece birkaç saniye içinde toplanabilir. Motorlu xy kademesi kullanılarak sonradan elde edilen IR görüntüleri bir araya getirerek geniş numune alanları ölçülebilir. HYPERİON 3000'deki piksel çözünürlüğü mevcut tüm hedefler için çok yüksek olduğundan, çözme gücü yalnızca ışığın kırınımı ile sınırlıdır.

HYPERİON ile veri toplama, yazılım, ölçüm ayarlarının seçimi yoluyla görsel numune incelemesinden son ölçüme kadar farklı mikroanaliz adımlarında kullanıcıya rehberlik ettiği için çok kolay bir şekilde gerçekleştirilir. Ölçülen tek veya 3B verilerden ilgili bilgileri çıkarmak için opus'ta birçok tek değişkenli ve çok değişkenli algoritma uygulanır. Ortaya çıkan IR görüntüleri, görünür görüntünün üstünde veya yanında farklı 2B ve 3B perspektiflerde görüntülenebilir.

Meme dokusunda sağlıklı ve kanserli bölgelerin farklılaşması

Aşağıdaki örnek, bir kanser hücresi kümesi içeren meme dokusunun analizini göstermektedir. Dokuların IR mikroskobik analizine izin vermek için numunenin bir mikrotom ile ince bir kesite (tipik olarak <10 µm kalınlık) kesilmesi gerekir, bu daha sonra IR şeffaf bir pencereye (CaF2) yerleştirilir ve iletimde ölçülmeden önce kurutulur. Bu örnekte, 4 cm^-1 spektral çözünürlük ve 10.8µm piksel çözünürlüğü ile yaklaşık 1 x 1 mm'lik bir alan görüntülenmiştir. Şekil 2, tek tek biyolojik bileşenler veya özel özellikler (kanser hücrelerinde olduğu gibi) için karakteristik olan görüntüleme spektrumlarının belirli bant konumlarının entegre edilmesiyle oluşturulan renk kodlu kimyasal görüntüleri göstermektedir. Renk kodlaması ilgili bandın yoğunluğunu gösterir: Siyah, en düşük değerleri, ardından en yüksek değerler için yeşil, mavi / mor, kırmızı ve beyazı gösterir.

Şekil 2: Tek tek biyolojik bileşenlerin veya belirli özelliklerin dağılımını gösteren renk kodlu kimyasal görüntüler: Kanserli bölge (sol üst), karbonhidratlar (sağ üst), kolajenler (sol alt) ve proteinler (sağ alt).

Tablo 1, farklı doku bileşenlerinin ilgili entegrasyon aralıklarını göstermektedir.

Birkaç kimyasal görüntünün bilgilerini birleştirmek için her bir görüntü / bileşen belirli bir renge atanır. "Kazanan Hepsini Alır" modunda, her bir piksel için baskın bileşen belirlenir ve ilgili renk atanır. Bu görüntü türü, bir görüntüde birden fazla bileşeni göstermek için özellikle kullanışlıdır. Şekil 3, tek bileşenlerin renk kodlu olduğu birleşik bilgileri göstermektedir: Sağlıklı doku mavi, kanserli bölge kırmızı, karbonhidrat yeşil, lipitler turuncu ve kollajen turkuaz olarak gösterilmiştir.

Şekil 3: Bir resimde dört ana biyolojik bileşeni gösteren WTA görüntüsü: Kanser hücreleri (kırmızı), karbonhidratlar (yeşil), sağlıklı doku (mavi), lipitler (turuncu, solda zar zor görülebilir) ve kollajen ((turkuaz).

Bitki dokusu: Bir buğday tohumunun analizi

Bu örnek, bir buğday tohumunun IR görüntüleme ile analizini göstermektedir. Numunenin ince kesitli mikrotom kesimi bir CaF2 penceresine yerleştirildi ve transmisyonda ölçüldü. Şekil 4, bir tohumun şematik yapısını göstermektedir. Mavi renkli dış tabaka, tohumu çevreleyen perikarp olarak adlandırılır; Bunu, çoğunlukla balmumundan yapılan tohum kabuğu (kırmızı renkli) takip eder. Bir sonraki katman (sarı ile gösterilmiştir), lipitler ve proteinler içeren aleuron katmanıdır. Yeşil renkte gösterilen endosperm, karbonhidratların depo dokusudur ve erken büyüme aşamalarında büyüyen bitkiye besin sağlar.

Şekil 4: Bir tohumun şematik yapısı. Üstten katmanlar: Pericarp (mavi), tohum kabuğu (kırmızı), aleuron (sarı) ve endosperm (yeşil).

Görsel görüntüde bu katmanlar yalnızca yapısal özellikler nedeniyle ayırt edilebilir, görsel kontrast çok düşüktür (bkz. Şekil 5). IR spektral verileri, tohumun farklı katmanları arasındaki biyokimyasal farklılıkları açıkça ortaya koymaktadır. Şekil 6, farklı katmanların örnek spektrumlarını göstermektedir. Üstteki spektrum endosperm tabakasından çıkarıldı. Tipik bir nişasta spektrumunun bantlarını gösterir. Ortada, sırasıyla 1650 cm^-1 ve 1550 cm^-1 merkezli karakteristik amid bantları ile aleuron tabakasının örnek bir spektrumu gösterilmektedir. Alttaki spektrum tohum kabuğundan gelir ve tipik olarak balmumunda bulunabilen karbonik asitlerin ve esterlerin (1733 cm^-1'de C = O değerlik bandı, 3000 cm^-1'in altındaki güçlü C-H değerlik bantları) spektral özelliklerini gösterir.  Karakteristik bantların entegrasyonu ile, Şekil 7'de tekrar WTA yaklaşımı kullanılarak birleştirilen kontrast bakımından zengin kimyasal görüntüler üretilir. Endosperm (yeşil, entegrasyon aralığı 1070 – 996 cm^-1), aleuron (sarı, 1758 – 1740cm^-1), tohum kaplama tabakası (kırmızı, 1744 – 1727 cm^-1) ve perikarp (mavi, 1349 – 1297 cm^-1) açıkça görülebilir.

Şekil 5: Buğday tohumunun görsel iletim görüntüsü.

Şekil 6: Örnek spektrumlar: Endosperm (üstte, yeşil), aleuron (ortada, sarı) ve tohum kabuğu (altta, kırmızı).

Şekil 7: Buğday tohumunun WTA görüntüsü: Perikarp (mavi), tohum kabuğu (kırmızı), aleuron (sarı) ve endosperm (yeşil).

Fare beyin örneğinde denatüre proteinlerin analizi

Bu örnek, hastalıklı bir sıçan beyninin analizini göstermektedir. Nörodejeneratif hastalıklar tipik olarak yapılarında doğal proteinlerden farklı olan denatüre proteinlerin oluşumunu içerir. Örneğin Alzheimer hastalığında Amiloid beta peptidi yanlış katlanır ve beyinde plak şeklinde toplanır. Analiz için, fare beyin örneğinin bir mikrotom bölümü, yansıma modunda bir ölçüme izin vermek için yansıtıcı substrat görevi gören altın bir aynaya yerleştirildi. Yaklaşık 500 x 900 µm'lik bir numune alanını kapsayan 3 x 5 FPA ölçümünden oluşan bir ızgara yapıldı. Yağ asitleri, karbonil bandının 1760 ile 1710 cm^-1 arasına entegre edilmesiyle belirlendi. Proteinlerdeki peptit bağlarından kaynaklanan amid I bandı, proteinin konformasyonuna duyarlıdır ve yerliyi denatüre proteinden ayırt etmek için kullanılmıştır. Doğal proteinler 1698 – 1652 cm^-1 arasında yüksek bir spektral yoğunluk gösterirken, denatüre proteinler maksimum bandın 1659 ila 1598 cm^-1bölgesine kayması ile karakterize edildi. Bu, moleküller arası β-tabaka olarak toplanan proteinler için tipik bir bant konumudur. Örnek olarak, Şekil 8, denatüre proteinlerin kimyasal görüntüsünü göstermektedir.

Şekil 8: Bir fare beyin örneğinin denatüre proteinleri için kimyasal görüntü.

Farklı doku tiplerinin konumuyla ilgili tüm bilgileri birleştirmek için bir WTA görüntüsü oluşturuldu. Şekil 9'daki görüntü yağ asitlerini kırmızı, doğal proteinleri mavi ve denatüre proteinleri yeşil olarak göstermektedir. Doğal protein bölgelerinin tümü, protein dejenerasyonunun yapıların dışından ilerlediğini düşündüren denatüre proteinlerle çevrilidir.

Şekil 9: Fare beyin örneğinin WTA görüntüsü: Yağ asitlerini (kırmızı), doğal proteinleri (mavi) ve denatüre proteinleri (yeşil) gösterir.

Özet

FT-IR görüntüleme, bitki ve hayvan dokusunda ana biyokimyasal bileşenlerin (örneğin lipitler, proteinler ve polisakkaritler) dağılımını gösteren kimyasal görüntüler oluşturmak için güçlü bir tekniktir. Ayrıca, elde edilen spektral bilgi, sağlıklı ve hastalıklı olanlar da dahil olmak üzere analiz edilen dokunun çeşitli özelliklerini ayırt etmeyi sağlar. Yöntem herhangi bir etiketleme gerektirmediğinden ve bu nedenle mevcut boyama tekniklerinden çok daha hızlı sonuçlar sağladığından, araştırmacılar gelecekte tıbbi teşhis için değerli bir araç olmasını bekliyorlar.

HYPERİON 3000, üst düzey araştırma uygulamaları için gereken maksimum hassasiyet ve çözünürlük gücünü sağlayan bir FT-IR görüntüleme mikroskobudur.