Uygulama Notu AN B408

MIR spektroskopisi kullanılarak biradaki nitrojen bileşiklerinin belirlenmesi

Biradaki nitrojen bileşiklerinin analizi, kalite kontrolü için önemli bilgiler sağlar. Kemometrik değerlendirme yöntemiyle birlikte mikroplakaların kullanıldığı orta kızılötesi spektroskopi, toplam çözünmüş nitrojenin, serbest amino bileşiklerin ve yüksek moleküler ağırlıklı nitrojen bileşiklerinin kolay ve eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak tanır. Yüksek numune verimi ve ilave kimyasalların bulunmaması bu yeni yöntemin diğer avantajlarıdır.

Bira üretim sürecindeki nitrojen bileşikleri

Azot bileşikleri, özellikle proteinler, peptitler ve serbest amino asitler, bira üretim sürecinde önemli bir rol oynar; [1]. Örneğin amino asitler ve amonyum tuzları, mayanın ana nitrojen kaynağı olduklarından fermantasyon işlemi için gereklidir. Ayrıca bunların konsantrasyonları fermantasyon yan ürünlerinin üretimi ile yakından bağlantılıdır. Biranın filtrelenebilirliği büyük ölçüde yüksek molekül ağırlıklı proteinin konsantrasyonuna bağlıdır. Orta ve özellikle yüksek molekül ağırlıklı nitrojen bileşikleri köpük stabilitesini, biranın tadını ve koloidal stabiliteyi (depolama kalitesi) doğrudan etkiler. Farklı nitrojen bileşiklerinin bu ürün özellikleri üzerinde farklı etkileri olduğundan, yalnızca toplam nitrojen miktarının ölçülmesi değil, aynı zamanda bireysel madde gruplarının konsantrasyonlarının da ölçülmesi gerekir [2]. Bira üretim sürecinin son ürünleri, ilgili bira üretim birlikleri tarafından tanımlanır. Tüm bu yöntemler yoğun emek gerektirir, zaman alıcıdır ve kısmen zararlı veya toksik kimyasallar gerektirir. Dahası, bu yöntemler, demleme işlemi sırasında hat üzerinde yapılabilecek bir analize izin vermez.

Şekil 1.) IR spektroskopisi için silikon mikroplakalar; IR mikroplaka modülü HTS-XT

MIR Spektroskopisi ve kemometrik değerlendirme

MIR spektrumları için hem numunenin niteliksel bileşimi hem de bireysel bileşenlerin konsantrasyonu belirlenebilir. Klasik değerlendirme yöntemleri, belirli bir bileşene özel bir bandın yüksekliğini veya alanını kullanarak Lambert-Beer yasasına dayanarak MIR spektrumlarını değerlendirir. Pek çok maddenin karmaşık karışımlarından kaynaklanan IR spektrumlarının analizi için bu yöntem, örtüşen bantlar nedeniyle çoğu zaman uygulanamaz. Bu nedenle PLS gibi kemometrik değerlendirme yöntemlerinin uygulanması gerekmektedir.

Kalibrasyon için temsili kalibrasyon numunelerinin konsantrasyon değerlerinin bağımsız bir referans yöntemi kullanılarak mümkün olduğu kadar kesin olarak belirlenmesi gerekir. Daha sonra Kısmi En Küçük Kareler (PLS) algoritması, kalibrasyon spektrumları ile referans değerleri arasındaki ilişkiye yönelik bir matematiksel model hesaplar. Model kurulduktan, optimize edildikten ve doğrulandıktan sonra bilinmeyen numunelerin konsantrasyonları, spektrumları temel alınarak hızlı ve kolay bir şekilde belirlenebilir. Sonuçların elde edilen doğruluğu, referans yöntemin doğruluğuna bağlıdır (yani sonuçlar referans yöntemden daha iyi olamaz!).

Birçok madde MIR bölgesinde güçlü bir şekilde emilir, böylece Lambert-Beer yasasına göre numunenin yalnızca küçük bir yolu yeterli olur. Suyun OH bantları diğer numune bileşenlerinin bantlarıyla geniş ölçüde örtüştüğünden, sulu numunelerin MIR analizi yalnızca çok ince küvetlerde (< 10 µm) veya suyun uzaklaştırılmasından sonra mümkündür. Mikro plakada (Şekil 1) bu, numunenin birkaç mikrolitresinin numune konumunda kurutulmasıyla gerçekleştirilebilir. Sonuç, artık MIR spektroskopisi kullanılarak geçirgenliği ölçülebilen, çözünmüş bileşenlerin ince bir filmidir. Bu ölçüm yönteminin bir diğer avantajı, mikroplaka başına tipik olarak 96 veya 384'e kadar bireysel ölçümle yüksek numune verimidir.

Örnekler ve Referans Yöntemi

Örnek setimiz yerel satıcılardan satın alınan 31 farklı biradan oluşuyordu. Numune setinde 27 Pilsener birasının yanı sıra test amaçlı bir alkolsüz bira ve üç siyah bira da yer aldı. Başka bir 6 "yapay" bira örneği, bir biranın (Vivacell 70, MWCO=5000; Vivascience, Hannover) ultrafiltrelenmesi ve orijinalin, filtrede kalan kısmın ve filtratın farklı karışımlarının hazırlanmasıyla üretildi.

MEBAK'a (Mitteleuropäische Brautechnische Analiz Kommission) göre, tüm numuneler, fotometrik ninhidrin yöntemi kullanılarak serbest amino nitrojen (FAN) açısından ve Kjeldahl yöntemi kullanılarak toplam nitrojen (TN) ve yüksek molekül ağırlıklı nitrojen (HMN) (magnezyum sülfat işleminden sonra çöken nitrojen) açısından analiz edildi. Tespitler iki kez tekrarlandı ve ninhidrin testi sırasında üç kez tekrarlandı.

Şekil 2.) Biradaki fanın belirlenmesi için tanımlanmış kurutma koşullarının sağlanması için çapraz doğrulamanın sonucu.

Analiz sonuçları 63 - 194 mg/l FAN, 461 - 1434 mg/I (TN) ve 83 - 185 mg/l (HMN) aralığında olmuştur. Referans ölçümünün tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için bir bira numunesi beş kez analiz edildi ve %2,5 (FAN), %3,0 (TN) ve %1,0 (HMN) bağıl standart sapma ortaya çıktı.

MIR ölçümleri, TENSOR 27 FT-IR spektrometresine bağlı Bruker Optic'in HTS-XT mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak yapıldı. Her numuneden 10 ul, silikon mikrotitre plakası üzerindeki üç numune pozisyonuna pipetlendi ve oda sıcaklığında kuruması için inkübe edildi (yaklaşık 15 - 20 dakika). Ölçüm verileri, OPUS/QUANT yazılımının bir PLS algoritması (Kısmi En Küçük Kareler) kullanılarak kemometrik olarak değerlendirildi.

Bulgular

Numune sayısının az olması nedeniyle PLS kalibrasyonunun doğrulanması için “Çapraz Doğrulama” seçeneği seçildi. Bu durumda kalibrasyon başlamadan önce bir numune numune setinden çıkarılır. Kalan numuneler sistemi kalibre etmek için kullanıldı. Daha sonra, hariç tutulan numune (bilinmeyen bir numune olarak kabul edilir) kemometrik modeli test etmek için kullanılır. Bu prosedür numune setinin her numunesi için tekrarlanır. Şekil 2'de, FAN için çapraz doğrulamanın sonuçları karşılık gelen referans değerlerine göre çizilmiştir. Tablo 1, ölçülen üç bileşenin tümü için ilgili istatistiksel parametreleri içerir. Tahminin ortalama hatası, referans verilerinin ortalama değerine göre %5 - 7 arasındadır.

Sonuçlar

MIR spektroskopisi ve kemometrik değerlendirme yöntemleri kullanılarak biradaki farklı nitrojen bileşiklerinin konsantrasyonu hızlı ve doğru bir şekilde belirlenebilir. Bu analitik yöntemin en büyük avantajı, toplam nitrojen, serbest amino nitrojen ve yüksek molekül ağırlıklı nitrojen gibi çeşitli bileşenlerin konsantrasyonunun, yalnızca tek bir ölçümle ve ek kimyasal reaktiflere ihtiyaç duymadan eş zamanlı olarak belirlenebilmesidir. Kalibrasyon setine daha fazla numune dahil edilerek ve tanımlanmış kurutma koşulları sağlanarak bu yöntemin daha da geliştirilmesi sağlanabilir.

Tablo 1: 31 biradaki nitrojen bileşiklerinin IR spektroskopik tespitinin sonuçları.

Referanslar

[1] Narziß, L.: Abriß der Bierbrauerei, Enke, Stuttgart,

1995

[2] Schlecht, E.: Brauwelt 126, 54-60 (1986)

[3] Pfenninger, H. (Hrsg.): Brautechnische Analysen

methoden (Band II), Selbst-verlag der MEBAK,

Weihenstephan, 1993